免疫组化实验步骤:从样本处理到结果分析全面指南

免疫组化(Immunohistochemistry, IHC)是一种广泛应用于生物医学研究及临床诊断的技术,它利用特异性抗体与组织或细胞中的抗原结合,通过显色反应来定位、定性及半定量分析目标分子。本文将详细介绍免疫组化实验的完整步骤,包括样本处理、抗体孵育、显色反应及结果分析等关键环节。

一、实验前准备

  • 选择并收集合适的组织样本,确保样本新鲜且固定得当。
  • 准备所需试剂:包括固定液、脱水剂、透明剂、石蜡、抗体、二抗、显色剂等。
  • 检查实验设备:确保显微镜、切片机、烘箱等仪器处于良好工作状态。

二、样本处理

  1. 固定:将组织样本浸泡在适当浓度的固定液中(如10%福尔马林),固定时间根据样本类型调整,一般为24-48小时。
  2. 脱水:使用梯度乙醇溶液(如70%、80%、90%、95%、100%)逐步脱水,每步约30分钟。
  3. 透明:将脱水后的样本置于二甲苯中透明,以替换组织中的乙醇,便于后续浸蜡。
  4. 浸蜡与包埋:将透明后的样本浸入熔化的石蜡中,随后进行包埋,冷却凝固后形成蜡块。
  5. 切片:使用切片机将蜡块切成薄片(一般为4-6微米),并贴附于载玻片上。
  6. 烤片:将载玻片置于60°C烘箱中烘烤1-2小时,以去除多余石蜡并增强组织附着力。

三、免疫组化染色

  1. 脱蜡与水化:依次将切片浸入二甲苯、梯度乙醇溶液中,最后用水冲洗,使组织恢复水合状态。
  2. 抗原修复:采用热修复或酶修复法,暴露被遮蔽的抗原决定簇,提高抗体结合效率。
  3. 阻断内源性过氧化物酶:使用3%过氧化氢溶液处理切片,减少非特异性染色。
  4. 封闭:用血清或封闭液孵育切片,减少非特异性抗体结合。
  5. 一抗孵育:滴加一抗至切片上,置于湿盒中,4°C过夜或室温孵育1-2小时。
  6. 洗涤:用PBS缓冲液洗涤切片,去除未结合的一抗。
  7. 二抗孵育:滴加与一抗匹配的二抗,室温孵育30分钟至1小时。
  8. 洗涤:再次用PBS缓冲液洗涤。
  9. 显色反应:根据使用的显色系统(如DAB、AEC等),滴加显色剂,观察颜色变化,适时终止反应。
  10. 复染与脱水:使用苏木精复染细胞核,随后进行梯度乙醇脱水。
  11. 透明与封片:二甲苯透明后,用中性树胶封片。

四、结果分析与解读

在显微镜下观察切片,根据显色情况判断目标抗原的分布与表达强度。注意区分特异性染色与非特异性背景染色,必要时进行阴性对照和阳性对照实验以验证结果可靠性。

免疫组化实验的成功与否不仅取决于实验操作的规范性,还与抗体的特异性、样本的处理质量等因素密切相关。因此,在实验过程中需严格控制各步骤条件,确保结果的准确性和可重复性。

五、注意事项

  • 实验过程中应佩戴防护手套和口罩,避免有害试剂直接接触皮肤和吸入。
  • 每次操作前确保所有试剂新鲜有效,避免使用过期或变质的试剂。
  • 严格控制孵育时间和温度,避免抗体失活或非特异性结合。
  • 实验结束后,及时清理实验台和仪器,保持实验室整洁。

通过遵循上述步骤和注意事项,您可以成功完成免疫组化实验,为科研和临床提供有价值的数据支持。

免疫组化实验步骤

By admin

发表回复